甲型流感病毒(IAV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)新品
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
商品名稱(chēng):甲型流感病毒(IAV)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)新品
Name :Avian Influenza Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
甲型流感是由甲型流感病毒(AIV)引起的一種禽類(lèi)傳染病,雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽均可感染,發(fā)病情況
差別較大,有的出現(xiàn)急性死亡,有的無(wú)癥狀帶毒。水禽是 AIV 的自然宿主,也是流感病毒的天然基因庫(kù),幾乎
所有亞型的流感病毒都可以在水禽中分離到[1]。在世界范圍內(nèi),家禽中流行的主要有 H5、H6、H7、H9 等亞型。
H5 和 H7 亞型的某些毒株可以造成禽類(lèi)很高的發(fā)病率和死亡率,被稱(chēng)為高致病性甲型流感(HPAI)病毒。OIE 將
高致病性甲型流感列為 A 類(lèi)動(dòng)物疫病,我國(guó)也將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[2-3]。
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理,檢測(cè)甲型流感病毒,對(duì)甲型流感診斷有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)甲型流感病毒 M 基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含甲型流感病毒基
因組模板的情況下,PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì) PCR 過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)
監(jiān)測(cè)和輸出,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性、定量分析。
【試劑組成】
注:1)不同批號(hào)試劑不能混用。
2)試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò)5 次,有效期12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺動(dòng)物,取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織;待檢活動(dòng)物,用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄
物,置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò) 6 個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,
嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生
理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離
心管中;棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1.2 核酸提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提
取,請(qǐng)按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)
每滿(mǎn)10 份,多配制1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,
短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;熒光通道選擇:
檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇ROX 參比熒光,
選擇None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline 和Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像
調(diào)節(jié)Baseline 的start 值(一般可在3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold 的
Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽(yáng)性:檢測(cè)通道Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線;
可疑:檢測(cè)通道35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線,
判定為陽(yáng)性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果Ct 值>38 或無(wú)Ct 值。
6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無(wú)Ct 值顯示;
陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且Ct 值≤32;以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
7.檢測(cè)方法的局限性
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
2.樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;
3.陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;
4.病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
5.不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
6.試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;
7.本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
1.所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,混勻并短暫離心;
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服;
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
【參考文獻(xiàn)】
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Reviews, 1992, 56(1): 152-179.
[2] Shortridge K. Avian influenza A viruses of southern China and Hong Kong: ecological aspects and implications for
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[3] 張燁, 舒躍龍. 2004–2012 年我國(guó)甲型流感流行情況 [J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志, 2013, 27(3): 239-240.【生
產(chǎn)企業(yè)】
企業(yè)名稱(chēng):上海晅科生物科技有限公司